Budowa rozpoczęła się 17 kwietnia 1565 r. W celu zbudowania kościoła dla Zakonu Rycerzy św. Stefana, założonego przez Wielkiego Księcia Cosimo de 'Medici w celu zwalczania piractwa Saracenów na Morzu Śródziemnym. Projekt z projektami i nadzorem Giorgio Vasariego i Davida Fortiniego polegał na zbudowaniu kościoła na miejscu starszego kościoła zwanego San Sebastiano alle Fabbriche Maggiori, datowanego co najmniej na 1074 r. Nowy kościół na miejscu został poświęcony 21 grudnia 21 , 1569. Fasada w białym marmurze została zaprojektowana przez Don Giovanni de 'Medici, nieślubnego syna Cosimo I, z pomocą Alessandro Pieroni; ich projekty zostały wybrane na podstawie oryginalnego planu Vasariego. Napis upamiętnia ukończenie za panowania Ferdinando I de 'Medici.

Dzwonnica, również zaprojektowana przez Vasariego, została ukończona przez Giovanniego Fancelliego w 1572 roku. Głównym projektem ołtarza był Pier Francesco Silvani. W ciągu następnych dwóch stuleci zaproponowano i wprowadzono wiele zmian i uzupełnień, w tym plany Gherardo Mechini, Paolo Guidottiego, Ranieri Gherardi, Torpè Donati, Alessandro Gherardesca, Florido Galli, Niccolò Matasa i Pasquale Poccianti. Ostateczna rekonstrukcja w 1859 r., Zakończona po stłumieniu zamówienia, tworzy jaśniejszą systematyzację wnętrz kolumn, które widzimy dzisiaj.
W kościele znajdują się liczne sztandary trofeów, zdobyte podczas morskich spotkań z piratami Saracenów. Czcionka na wodę święconą (1568) została wyrzeźbiona przez Giovanniego Fancellego, na podstawie projektów Vasariego.

W kontrfazie znajduje się pięć monochromatycznych obrazów Opowieści o św. Stefanie Papieża i Męczennika, w tym jeden obchodzący wejście Ferdinando I 31 marca 1588 roku. Ten wielki książę miał zlecić drewniany sufit Bartolomeo Atticciati ( 1604).

Sufit ma sześć obrazów na drewnie przedstawiających epizody wydarzeń historycznych, w których działał zakon wojskowy, w tym przyznawanie mundurów przez Cosimo I de 'Medici przez il Cigoli, Powrót floty z bitwy pod Lepanto i Sacking of Prevesa Jacopo Ligozzi, Embarcation w Livorno Maria de 'Medici Allori, Zwycięstwo w greckim archipelagu i Capture of Bona przez l'Empoli.

Polichromowana ambona (1627) została ukończona przez Chiarissimo Fancelli. Zawiera obrazy pisarza Aurelio Lomi Madonny i dziecka ze świętymi Józefem i Stefano (1593) oraz obraz pałacu Zakonu.
Ołtarz główny (1702–1709) w prezbiterium został zaprojektowany i wyrzeźbiony przez Giovanniego Battistę Fogginiego z posągiem papieża św. Stefana i alegorycznymi figurami religii i wiary, a na tronie z brązu relief z dekapitacją św. Stefano. Po prawej stronie znajduje się obraz Giorgio Vasariego z grobem św. Stefana (1571), a po prawej narodziny Chrystusa (1564) autorstwa Bronzino.

W zakrystii jest grupa rzeźbiarska Fogginiego ze św. Stefana i alegoria Rozumu i Trójcy (1683), wykonana z okazji przekładu ciała świętego na ten kościół w 1682 r.

Kaplica Najświętszego Sakramentu została ukończona w 1837 r. przez Florido Galliego.